Validação específica por tecido de genes de referência para análises precisas de qRT-PCR durante a diferenciação sexual em Amphiprion ocellaris
Boonphakdee, C.Thamnawasolos, J.Boonphakdee, T.Mataroepayotorn, T.
Resumo A PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR) é um método amplamente utilizado para medir a expressão gênica, mas sua confiabilidade depende do uso de genes de referência estáveis para a normalização. Este estudo avaliou a estabilidade de expressão de quatro genes de manutenção comumente utilizados — 18S rRNA, ef1α, rpl8 e β-actin — em Amphiprion ocellaris, um hermafrodita protândrico regulado socialmente. Tecidos cerebrais e gonadais foram amostrados de indivíduos em diferentes estágios de desenvolvimento e tipos sexuais, incluindo juvenis, indivíduos em transição e casais reprodutores. Para avaliar mais amplamente a estabilidade entre tecidos, 11 tecidos diferentes também foram analisados em adultos reprodutores. A estabilidade da expressão gênica foi avaliada usando o RefFinder, que integra quatro algoritmos consagrados. Entre os candidatos, o 18S rRNA foi consistentemente classificado como o mais estável entre os tecidos e métodos de análise, enquanto a β-actin apresentou a maior variabilidade e foi o gene menos confiável. A validação utilizando dois genes relacionados à diferenciação sexual, cyp19a1a e cyp19a1b, normalizados com 18S rRNA, confirmou perfis de expressão biologicamente consistentes e específicos por tecido. Esses resultados identificam o 18S rRNA como o gene de referência mais adequado para estudos de qRT-PCR em A. ocellaris, com ef1α e rpl8 como alternativas potenciais para tecidos gonadais. O uso de genes de referência validados é essencial para análises precisas de expressão gênica em estudos sobre diferenciação sexual e plasticidade reprodutiva em teleósteos hermafroditas sequenciais.
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